혈액 단계에서 생체 내 배양과 시험관 배양 사이의 바베시아 깁소니(우한 분리주)의 전사 변이

기생충 및 벡터 16권, 기사 번호: 268(2023) 이 기사 인용

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개 바베시아증의 원인균인 바베시아 깁소니(Babesia gibsoni)는 문단복합체(문 Apicomplexa)에 속합니다. 체외 배양 기술의 개발은 Plasmodium spp.의 전사체 분석을 포함하여 다양한 종류의 omics 연구에서 연구 발전을 주도했습니다. 시험관 내 환경과 생체 내 환경 사이에서 진단 항원의 관찰과 백신 개발이 촉발되었습니다. 그럼에도 불구하고 Babesia spp.에 대한 정보는 없습니다. 이 점에서 얻을 수 있으며 이는 혈액 단계에서 기생충 성장과 발달에 대한 추가 이해를 크게 방해합니다.

이 연구에서는 생체 내 기생충과 비교하여 연속적으로 시험관 내에서 배양된 B. gibsoni(우한 분리균)의 형태 및 감염성에 상당한 변화가 관찰되었습니다. 이러한 변화를 바탕으로 B. gibsoni(Wuhan isolate)를 생체 내 및 시험관 내 배양에서 수집한 다음 전체 RNA 추출 및 Illumina 전사체 서열 분석을 수행했습니다. 획득된 차별적으로 발현된 유전자(DEG)는 qRT-PCR을 사용하여 검증된 후 여러 데이터베이스를 통해 기능적으로 주석을 달았습니다. 시험관 내 배양 후 가장 큰 상향 조절을 보이는 유전자는 B. gibsoni(Wuhan isolate)의 게놈에서 복제되었으며, 기본 형태와 세포 위치를 검출하기 위한 Western blotting 및 간접 면역형광 분석을 특징으로 합니다.

실험실 배양을 통해 다양한 형태의 기생충이 관찰되었으며, 개에서 체외 배양된 기생충의 감염성이 낮은 것으로 나타났습니다. 이러한 변화를 기반으로 Illumina 전사체 시퀀싱을 수행하여 377개의 고유 유전자가 상향 조절되고 334개의 고유 유전자가 하향 조절되었음을 보여줍니다. 특히 기생충의 모든 발달 단계에 필수적인 AP2 전사 인자 계열을 선별하고 이러한 계열 구성원의 전사 변화를 테스트했습니다. 따라서, 시험관내 적응 후 가장 높게 상향조절된 발현을 갖는 신규 AP2 전사 인자 유전자(BgAP2-M)가 선택되었다. 이 유전자는 662개 아미노산의 전장 단백질을 암호화하는 1989개 염기쌍의 개방형 판독 프레임(ORF)으로 구성됩니다. BgAP2-M은 하나의 AP2 도메인과 하나의 ACDC 보존 도메인을 포함하며 이는 기생충의 핵 생물학에 관여할 수 있습니다. BgAP2-M 펩타이드에 대해 준비된 다클론 항체는 ~73 kDa의 원래 크기를 추가로 검출했으며 B. gibsoni의 핵에 국한되었습니다.

이 연구는 처음으로 생체 내 및 시험관 내에서 B. gibsoni의 철저한 전사체 분석을 제시하여 환경 변화가 혈액 단계에서 기생충의 성장 및 발달에 미치는 영향에 대한 자세한 이해에 기여합니다. 또한 Babesia spp.의 다양한 수명 단계 조절자로서 ApiAP2 전사 인자 계열의 다양한 구성원에 대한 심층 조사도 제공합니다.

바베시아(Babesia) 종은 분류학적으로 문 Apicomplexa, Piroplasmea 강, Piroplasmida 목 및 Babasidae과로 분류되는 절대적혈구내 혈원생동물입니다[1,2,3]. 바베시아 깁소니(Babesia gibsoni)는 용혈성 빈혈, 혈색소뇨증, 저혈압 쇼크 및 사망과 같은 전형적인 개 바베시아증 증상을 유발하는 혈원생 기생충이다[4,5,6]. 이 유기체는 또한 언덕이 많은 야생 지대에 널리 분포하는 Haemaphysalis longicornis에 의해 경난소 전파됩니다[7,8,9,10].

Babesia bovis, B. bigemina, B. gibsoni, B. orientalis, Plasmodium falciparum 및 P. Knowlesi를 포함한 다양한 apicomplexan 기생충에 대한 실험실 체외 배양 시스템이 확립되었습니다 [11,12,13,14,15]. 물리적, 영양적, 면역학적 요인을 포함한 여러 가지 체외 환경 요인으로 인해 기생충은 형태, 감염성 및 병독성에 눈에 띄고 의미 있는 변화를 보이는 경향이 있습니다. 예를 들어, B. gibsoni Oita 분리균의 경우 장기 시험관 내 배양으로 인해 숙주 적혈구에서 더 크고 다양한 형태의 기생충이 나타났고 개에서는 기생충 감염성이 낮아졌습니다[13, 16]. 따라서 더 깊은 전사 변화는 자극적이고 중요한 것으로 생각됩니다. 그러나 in vitro 배양에 의해 영향을 받는 유전자의 변화는 P. falciparum과 P. Knowlesi 모두에서 조사되었습니다 [17,18,19,20]. 이러한 변화는 때때로 기생충이 주변 환경에 적응하여 더 나은 생존과 번식을 일으킨다는 것을 의미합니다 [21]. 예를 들어, 일부 성기 유전자(gamete 항원 27/25)와 무성기 침입 및 성장과 관련된 기타 유전자(MSP7, DOC2 및 CLAMP)는 전염될 가능성이 훨씬 적기 때문에 상대적으로 큰 전사 변이가 있는 것으로 확인되었습니다. 새로운 모기 벡터에 감염될 가능성이 높으며 시험관 내 환경에서 숙주 적혈구에 침입할 가능성이 더 높습니다 [17, 19]. 특히, 다양한 ApiAP2 전사 인자도 어느 정도 전사 변화를 겪었습니다. 1~3개의 DNA 결합 도메인을 가진 이 단백질 계열은 apicomplexan 유기체에서 가장 큰 전사 인자 계열로 확인되었으며 기생충의 모든 발달 단계를 정확하게 조절합니다 [22, 23]. P. falciparum에서는 2개의 AP2 전사 인자인 PF3D7_1222600(PfAP2-G) 및 PF3D7_1222400(PfAP2-G4)이 조기 정지 코돈이 있는 기능 상실 넌센스 돌연변이를 가지고 있는 것으로 잘 문서화되어 있으며, 이는 게임 세포 생성 동안 유전자 전사를 엄청나게 억제합니다. . 또 다른 AP2 전사 인자(PF3D7_1342900, PfAP2-HS)는 3개의 무의미한 돌연변이로 검출되었으며, 이들 모두는 예측된 AP2 도메인의 상류에 존재하고 전체 길이의 단백질을 잘라냈습니다. PfAP2-HS의 전사에 영향을 미치는 이러한 돌연변이는 시험관 내 환경에서 온도 변동에 대한 내성이 향상된 결과일 가능성이 높습니다[18]. 더욱이, 최근 연구에서는 기능이 알려지지 않은 AP2 유전자(PF3D7_0420300)의 전사 수준이 증가한 것으로 관찰되었으며, 이는 무성 생식에 관여할 수 있습니다[19].